DNA-Sequenzierung: von Sanger bis Nanopore

Vertiefung zum ThemaKrankheitsgene

Das erste menschliche Genom zu lesen dauerte über ein Jahrzehnt und kostete Hunderte Millionen Dollar. Heute schaffen Labore das in wenigen Tagen für einen Bruchteil davon. Wie die DNA-Sequenzierung funktioniert – vom Kettenabbruch nach Sanger bis zur winzigen Pore, durch die ein DNA-Faden gezogen wird –, erfährst du hier.

Einfach erklärt

Diese Seite vertieft das Thema Krankheitsgene. Das Erbgut besteht aus vier Basen. Das sind Bausteine mit den Namen A, C, G und T. Ihre Reihenfolge enthält die Erbinformation. Das Bestimmen dieser Reihenfolge heißt Sequenzierung.

Es gibt drei wichtige Verfahren. Die Sanger-Methode stammt von 1977. Sie bricht das Kopieren vom Erbgut an zufälligen Stellen ab. Ein Gerät sortiert die Bruchstücke dann nach Länge. Neuere Geräte lesen Millionen kurze Stücke gleichzeitig. Ein Computer setzt sie wie ein Puzzle zusammen.

Das Wichtigste:

• Bei der Nanopore-Methode wandert ein langer Erbgut-Faden durch eine winzige Pore. Dabei verändert sich ein Strom. So erkennt das Gerät die Basen.
• 2001 kostet das Lesen vom ganzen Erbgut rund 95 Millionen US-Dollar. 2022 sind es etwa 525 Dollar.
• Der Preis gilt nur für das Lesen. Die Auswertung kostet extra.

Merke: Sequenzierung heißt: Die Basen im Erbgut der Reihe nach lesen.

Was ist DNA-Sequenzierung?

Die Erbinformation steckt in der Abfolge der vier Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T). Wer diese Abfolge kennt, kann Gene finden, Mutationen erkennen und Lebewesen miteinander vergleichen. Das Bestimmen der Basenfolge heißt Sequenzierung. Ein einzelnes Stück gelesener Sequenz nennt man Read (englisch für „Gelesenes“).

Grob lassen sich drei Generationen von Verfahren unterscheiden: die Sanger-Methode, mit der auch das Humangenomprojekt arbeitete, die Next Generation Sequencing (NGS), die seit 2008 die großen Labore prägt, und Verfahren, die sehr lange Einzelmoleküle lesen, etwa die Nanopore-Sequenzierung. Wie Forschende mit diesen Methoden Krankheitsgene aufspüren, zeigt das Hauptkapitel.

Sanger-Sequenzierung: die Kettenabbruch-Methode

Frederick Sanger und Kollegen veröffentlichten ihre Methode im Dezember 1977. Der Trick: Man lässt eine DNA-Polymerase einen neuen Strang an einer Vorlage aufbauen und bricht die Synthese an zufälligen Stellen gezielt ab.

1. AnsatzIn ein Reaktionsgefäß kommen die einzelsträngige Vorlage, ein kurzer Startabschnitt (Primer), DNA-Polymerase, die vier normalen Nukleotide (dNTPs) und eine kleine Menge Abbruch-Nukleotide (ddNTPs).
2. KettenabbruchDen ddNTPs fehlt am Zucker die 3′-OH-Gruppe, an die das nächste Nukleotid gebunden würde. Wird zufällig ein ddNTP eingebaut, endet der Strang. Weil das an jeder Position passieren kann, entstehen Bruchstücke jeder Länge.
3. TrennenDie Bruchstücke werden in einer dünnen Kapillare nach Länge getrennt, ähnlich wie bei der Gelelektrophorese. Kurze Stücke wandern schneller.
4. LesenEin Laser regt die Farbstoffe am Ende der Kapillare an. Die Abfolge der Farben, vom kürzesten zum längsten Stück, ist die Sequenz.

Ein Sanger-Lauf liefert einen Read von einigen Hundert Basen. Für ein ganzes Genom mit rund 3,1 Milliarden Basenpaaren braucht man deshalb unzählige Läufe. Für einzelne Gene oder zur Kontrolle eines Befunds wird die Methode aber bis heute eingesetzt.

Next Generation Sequencing: Millionen Stücke gleichzeitig

Die Next Generation Sequencing (NGS, auch Sequenzierung der zweiten Generation) liest nicht ein Stück nach dem anderen, sondern Millionen parallel. Das verbreitetste Verfahren funktioniert so: Die DNA wird in kurze Stücke zerlegt und mit kurzen Erkennungsstücken (Adaptern) versehen. Auf einer Glasplatte wird jedes Stück an seinem Platz vielfach kopiert, sodass winzige Gruppen identischer Moleküle entstehen. Dann wird Runde für Runde je ein farbig markiertes Nukleotid angebaut, eine Kamera fotografiert die Farbe jeder Gruppe, der Farbstoff wird entfernt, und die nächste Runde beginnt. Weil dabei in jeder Runde nur ein Baustein dazukommt, heißt das Prinzip Sequenzierung durch Synthese.

Die Reads sind kurz, meist nur einige Hundert Basen. Ein Computer legt sie wie Puzzleteile an eine bekannte Referenzsequenz an. Damit Lesefehler nicht ins Gewicht fallen, wird jede Stelle des Genoms mehrfach gelesen. Seit die vom NHGRI geförderten Sequenzierzentren im Januar 2008 auf NGS umgestiegen sind, sind die Kosten pro Genom regelrecht abgestürzt (Abb. 2). Auch der Bluttest in der Schwangerschaft beruht darauf: Beim NIPT werden Millionen DNA-Bruchstücke aus dem Blut sequenziert und den Chromosomen zugeordnet.

Nanopore-Sequenzierung: DNA durch ein Nadelöhr

Bei der Nanopore-Sequenzierung wird ein einzelner DNA-Strang durch eine winzige Pore in einer Membran gefädelt. Durch die Pore fließt ein Strom aus Ionen. Je nachdem, welche Basen gerade in der Pore stecken, wird dieser Strom auf typische Weise gestört. Aus dem Muster der Stromänderungen berechnet ein Programm die Basenfolge. Farbstoffe sind dafür nicht nötig, und die DNA muss nicht unbedingt vorher kopiert werden.

Der große Vorteil sind lange Reads. Während frühere Verfahren nur etwa 500 Basen am Stück lasen, schaffen Langlese-Verfahren heute über 100.000 Basen. Erst damit ließen sich lange, sich wiederholende Abschnitte des Genoms lückenlos zusammensetzen. 2022 gelang so die erste vollständige Sequenz eines menschlichen Genoms. Mehr dazu auf der Seite zum Humangenomprojekt. Weil methylierte Basen den Strom anders verändern als unmethylierte, lassen sich mit Nanoporen auch epigenetische Markierungen direkt erkennen.

	Sanger	NGS (kurze Reads)	Nanopore (lange Reads)
Prinzip	Kettenabbruch, Trennung nach Länge	Sequenzierung durch Synthese, Bilder von Farbsignalen	Stromänderung beim Durchtritt durch eine Pore
Länge eines Reads	einige Hundert Basen	meist einige Hundert Basen	Tausende bis über 100.000 Basen
Menge pro Lauf	ein Abschnitt	Millionen bis Milliarden Reads	viele lange Einzelmoleküle
typischer Einsatz	einzelne Gene, Kontrolle von Befunden	Exome, Genome, Tumoren, NIPT	schwierige, sich wiederholende Bereiche, schnelle Analysen vor Ort

Wie billig ist ein Genom geworden?

Das US-Genomforschungsinstitut NHGRI hat jahrelang die Kosten seiner Sequenzierzentren erfasst. Abb. 2 zeigt, was die Sequenzierung eines menschengroßen Genoms jeweils gekostet hätte.

Von rund 95 Millionen US-Dollar im Jahr 2001 sank der Preis auf etwa 1.250 Dollar im Jahr 2015 und etwa 525 Dollar im Jahr 2022. Wichtig beim Lesen solcher Zahlen: Das NHGRI rechnet nur die Kosten der eigentlichen Sequenzierung ein. Die Auswertung der Daten, die Deutung der gefundenen Varianten und die ärztliche Beratung kosten zusätzlich und sind oft der aufwendigste Teil.

Vertiefung Oberstufe: Von Millionen Reads zum Genom – Coverage und Wiederholungen

Wie oft eine Stelle im Durchschnitt gelesen wird, heißt Coverage (Abdeckung). Sie lässt sich überschlagen: Coverage ≈ Zahl der Reads · Länge eines Reads / Länge des Genoms. Ein Beispiel: 600 Millionen Reads mit je 150 Basen ergeben 90 Milliarden gelesene Basen. Geteilt durch rund 3,1 Milliarden Basenpaare sind das etwa 29: Jede Stelle wird im Mittel 29-mal gelesen. Weil die Reads zufällig verteilt sind, werden manche Stellen seltener getroffen, andere häufiger. Eine hohe Coverage sorgt dafür, dass kaum eine Stelle fehlt und einzelne Lesefehler durch die Mehrheit der Reads korrigiert werden.

Schwieriger wird es bei Wiederholungen. Besteht ein Abschnitt aus Tausenden fast gleicher Kopien einer kurzen Folge, sehen alle kurzen Reads daraus gleich aus. Der Computer kann sie keiner bestimmten Stelle zuordnen – wie bei einem Puzzle mit einem riesigen blauen Himmel. Deshalb blieben im Humangenomprojekt rund 8 Prozent des Genoms offen, vor allem in den Zentromeren und an den kurzen Armen einiger Chromosomen. Lange Reads überspannen solche Bereiche vollständig und machen ihre Struktur sichtbar.

Lange und kurze Reads ergänzen sich: Lange Reads liefern das Gerüst, kurze Reads mit hoher Genauigkeit helfen bei der Korrektur. Für viele medizinische Fragen genügt dagegen schon eine Sequenzierung des Exoms, also der proteincodierenden Abschnitte, die nur etwa 1,5 Prozent des Genoms ausmachen.

Fachbegriffe

Sequenzierung

Bestimmung der Basenfolge eines DNA-Abschnitts.

ddNTP

Didesoxynukleotid ohne 3′-OH-Gruppe; sein Einbau beendet die Verlängerung des Strangs.

Read

Ein einzelnes Stück gelesener Sequenz.

Next Generation Sequencing

Verfahren, die Millionen kurzer DNA-Stücke gleichzeitig sequenzieren.

Nanopore-Sequenzierung

Lesen einzelner DNA-Stränge über Stromänderungen beim Durchtritt durch eine Pore.

Coverage

Durchschnittliche Zahl, wie oft jede Stelle des Genoms gelesen wird.

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