Plasmide: die Genfähren der Gentechnik

Vertiefung zum ThemaInsulin aus Bakterien

Im November 1972 saßen zwei Forscher spätabends bei einer Tagung auf Hawaii zusammen und planten ein Experiment. Ein Jahr später hatten Herbert Boyer und Stanley Cohen fremde DNA in Bakterien geschleust. Ihr Werkzeug war ein winziger DNA-Ring: das Plasmid. Ohne Plasmide wäre auch Humaninsulin aus Bakterien kaum denkbar.

Einfach erklärt

Diese Seite vertieft das Thema „Insulin aus Bakterien“. Bakterien haben ihr Erbgut vor allem auf einem großen Ring. Viele haben zusätzlich Plasmide. Das sind kleine DNA-Ringe. Sie verdoppeln sich selbstständig. Manche Plasmide machen Bakterien unempfindlich gegen Antibiotika.

Die Gentechnik nutzt Plasmide als Genfähre. Ein Restriktionsenzym schneidet das Plasmid auf. Das ist eine Art Schere für DNA. Sie schneidet nur an einer bestimmten Stelle. Dann setzt man das neue Gen ein. Die Ligase ist eine Art Kleber für DNA. Sie verbindet die Stücke. Danach nehmen Bakterien das Plasmid auf.

Nur wenige Bakterien nehmen das Plasmid wirklich auf. Darum trägt das Plasmid ein Resistenzgen. Mit diesem Gen überleben die Bakterien ein Antibiotikum. Auf einem Nährboden mit Antibiotikum wachsen dann nur Bakterien mit Plasmid.

Merke: Ein Plasmid ist ein kleiner DNA-Ring, der ein fremdes Gen in Bakterien bringt.

Was ist ein Plasmid?

Bakterien tragen ihr Erbgut vor allem auf einem großen, ringförmigen Chromosom. Viele besitzen zusätzlich Plasmide: kleine, meist ringförmige, doppelsträngige DNA-Moleküle, die außerhalb des Chromosoms liegen und sich unabhängig davon verdoppeln. Bei der Zellteilung werden sie an die Tochterzellen weitergegeben. Typische Plasmide sind etwa 2000 bis 200 000 Basenpaare (2 bis 200 kbp) lang; es gibt aber auch Miniplasmide unter 1 kbp und Megaplasmide mit über 1000 kbp. Manche Plasmide kommen nur in wenigen Kopien pro Zelle vor, andere in vielen. Plasmide finden sich vor allem bei Bakterien und Archaeen, selten auch bei Eukaryoten, etwa als 2-Mikrometer-Ring in der Backhefe.

Für das Bakterium sind Plasmide eine Art Werkzeugkasten. Sie tragen Gene, die nicht immer, aber in bestimmten Situationen nützlich sind:

• Resistenzplasmide machen Bakterien unempfindlich gegen Antibiotika oder Gifte.
• F-Plasmide (Fertilitätsplasmide) tragen Gene, mit denen ein Bakterium eine Plasmidkopie über eine Zellbrücke an ein anderes weitergeben kann. Diesen Vorgang nennt man Konjugation.
• Abbauplasmide erlauben, ungewöhnliche Stoffe wie Toluol abzubauen; Virulenzplasmide machen aus harmlosen Bakterien Krankheitserreger.

Weil Plasmide zwischen Bakterien weitergegeben werden können, verbreiten sich Resistenzgene schnell. Das ist ein Grund dafür, warum Antibiotikaresistenzen in der Medizin ein so großes Problem sind.

Das Plasmid als Genfähre: die Bauteile

Was in der Natur Resistenzen verbreitet, nutzt die Gentechnik als Vektor, also als Transportmittel für Gene. Ein Plasmidvektor ist ein im Labor optimiertes Plasmid mit einigen festen Bauteilen (Abb. 1).

1. Replikationsursprung (ori)An dieser Stelle setzt die Verdopplung an. Ohne ori würde das Plasmid bei der Teilung verloren gehen.
2. SelektionsmarkerMeist ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum. Es zeigt später, welche Bakterien das Plasmid aufgenommen haben.
3. SchnittstellenEine kurze Region mit mehreren Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, die im übrigen Plasmid nicht vorkommen. Fachleute nennen sie Multiple Cloning Site (MCS).
4. PromotorEin Startsignal für die Transkription. Steht er vor dem eingesetzten Gen, liest das Bakterium das Gen ab und bildet das Protein.

Das erste Experiment dieser Art gelang 1973. Boyer und Cohen nutzten ein Plasmid namens pSC101, das E. coli gegen das Antibiotikum Tetracyclin unempfindlich machte. Sie kombinierten es mit einem zweiten Resistenzplasmid und brachten so DNA aus einer anderen Bakterienart, Staphylococcus, in E. coli zur Vermehrung.

Ein Gen ins Plasmid bringen: schneiden, kleben, einschleusen

Das bekannteste Restriktionsenzym ist EcoRI aus E. coli. Es erkennt die Basenfolge 5′-GAATTC-3′. Diese Folge ist ein Palindrom: Auf dem Gegenstrang lautet sie, wieder von 5′ nach 3′ gelesen, ebenfalls GAATTC. EcoRI schneidet beide Stränge zwischen G und A, also versetzt. Dadurch bleiben an beiden Bruchstücken kurze einzelsträngige Überhänge mit der Folge AATT stehen, die klebrigen Enden (Abb. 2).

1. SchneidenPlasmid und gewünschtes Gen werden mit demselben Restriktionsenzym behandelt. Das Plasmid wird an seiner Schnittstelle geöffnet, das Gen erhält passende klebrige Enden.
2. VerbindenBeide werden gemischt. Die klebrigen Enden lagern sich über Wasserstoffbrücken aneinander. Das Enzym DNA-Ligase verknüpft anschließend das Zucker-Phosphat-Rückgrat. Es entsteht ein rekombinantes Plasmid.
3. TransformationBakterien werden kurz durchlässig gemacht, zum Beispiel mit Calciumchlorid und einem Wärmeschock oder mit Stromstößen. Nur ein kleiner Teil der Zellen nimmt dabei ein Plasmid auf.
4. SelektionDie Bakterien kommen auf einen Nährboden mit Antibiotikum. Nur Zellen mit Plasmid und damit mit Resistenzgen bilden Kolonien.
5. Prüfen und vermehrenOb das Plasmid wirklich das richtige Gen enthält, wird zum Beispiel mit der Blau-Weiß-Selektion vorsortiert und dann molekular überprüft. Die passenden Bakterien werden vermehrt.

Genau so beginnt die Herstellung von Humaninsulin: Ein im Labor synthetisiertes Gen für Proinsulin wird zusammen mit einem Promotor in ein Plasmid eingesetzt und in E. coli gebracht. Wie es danach im Fermenter weitergeht, erklärt das Hauptkapitel Insulin aus Bakterien. Warum man überhaupt nach einer Alternative zum Insulin aus Schlachttieren suchte, zeigt die Seite Rinderinsulin und Schweineinsulin: Insulin vor der Gentechnik.

Vertiefung Oberstufe: Die Blau-Weiß-Selektion

Die Antibiotika-Selektion zeigt nur, dass ein Bakterium ein Plasmid aufgenommen hat, aber nicht, ob darin das gewünschte Gen steckt. Denn ein aufgeschnittenes Plasmid kann sich auch ohne Gen wieder schließen. Hier hilft die Blau-Weiß-Selektion.

Sie nutzt das Gen lacZ, das für das Enzym β-Galaktosidase codiert. Dieses Enzym spaltet normalerweise Milchzucker. Es spaltet aber auch den künstlichen Farbstoffvorläufer X-Gal, und dabei entsteht ein unlöslicher blauer Farbstoff. Der Trick besteht aus zwei Hälften:

• Die verwendeten E. coli-Stämme besitzen ein verkürztes lacZ-Gen (lacZΔM15). Allein bilden sie kein funktionsfähiges Enzym.
• Das Plasmid, zum Beispiel pUC19, liefert das fehlende kleine Stück, das α-Peptid. Beide Teile zusammen ergeben wieder ein aktives Enzym. Man nennt das α-Komplementation.

Entscheidend ist: Die Schnittstellen (MCS) liegen mitten im Abschnitt für das α-Peptid. Wird dort ein Gen eingesetzt, ist der Abschnitt unterbrochen, und es entsteht kein funktionsfähiges Enzym. Auf einem Nährboden mit Antibiotikum, X-Gal und dem Auslöser IPTG, der das lac-Gen anschaltet, gilt deshalb:

• Blaue Kolonie: Plasmid ohne eingesetztes Gen, das Enzym arbeitet.
• Weiße Kolonie: Plasmid mit eingesetzter DNA, das Enzym fehlt.

Ganz sicher ist der Test nicht: Eine weiße Kolonie zeigt nur, dass irgendein Stück DNA den Abschnitt unterbricht, nicht unbedingt das gewünschte Gen. Sehr selten bleibt eine Kolonie trotz kleiner Einfügung blau. Deshalb werden weiße Kolonien anschließend etwa mit PCR oder einem Kontrollschnitt mit Restriktionsenzymen überprüft.

Fachbegriffe

Plasmid

Kleines, meist ringförmiges DNA-Molekül in Bakterien, das sich unabhängig vom Chromosom verdoppelt.

Vektor

Transportmittel, mit dem ein Gen in eine Zelle gebracht wird, zum Beispiel ein Plasmid oder ein Virus.

Restriktionsenzym

Enzym, das DNA an einer bestimmten kurzen Basenfolge schneidet.

Klebrige Enden

Einzelsträngige Überhänge nach einem versetzten Schnitt, die sich mit passenden Enden paaren.

DNA-Ligase

Enzym, das DNA-Stücke durch Verknüpfen des Zucker-Phosphat-Rückgrats verbindet.

Transformation

Aufnahme freier DNA, etwa eines Plasmids, durch eine Bakterienzelle.

Weiterlernen